植物ウイルス増殖の初期過程における複製酵素の局在を生細胞で観察することに成功

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植物ウイルス増殖の初期過程における 複製酵素の局在を生細胞で観察することに成功

　国立大学法人新万博体育_万博体育官网-【官方授权牌照】大学院生 石原千有沙（研究当時）、角田友弘（研究当時）、同大学大学院農学研究院生物制御科学部門の小松健教授、同研究院応用生命化学部門の佐々木信光准教授、学術研究支援総合センターの松下保彦教授、および同大学大学院農学研究院生物制御科学部門の有江力教授、オクラホマ州立大学のRichard Nelson博士による国際共同研究グループは、遺伝子コード型の抗体プローブ（注1）を用いて、植物ウイルスが感染した生細胞における複製酵素（注2）の観察（生細胞イメージング）に成功しました。本成果は、エピトープタグとそれに結合する抗体プローブを利用した生細胞イメージング技術を、世界で初めて植物ウイルスに適用したものであり、目的タンパク質の簡便な可視化技術として、植物におけるタンパク質の動態イメージングへの広い活用が期待されます。

現状と研究背景
　ウイルスは、人間だけでなく、植物や菌類を含むさまざまな生物に感染し、増殖する微小な寄生体です。植物ウイルスは多くの農作物に感染し被害をもたらします。特に近年は、世界で新たに発生が報告された植物病のうち半数以上がウイルス病であるとの報告もあり、その制御の重要性はますます高まっています。一方で、植物ウイルスの感染を抑える薬剤は開発されておらず、将来的な植物ウイルスの被害を抑えるためには、植物ウイルスの増殖機構、特に細胞でその数を増やす「複製」のしくみの理解が非常に重要です。
　動植物に感染するほとんど全てのウイルスは、自身のゲノム（注3）を複製させるために複製酵素というタンパク質を持ちます。ウイルス複製は、この複製酵素が主導し、宿主細胞の細胞内膜系（注4）を利用して行われます。すなわち、ウイルスが細胞に侵入するとまず複製酵素により細胞内膜系が改変され、小胞状の膜構造におおわれた複製装置が形成されます。ウイルスは複製装置により宿主細胞の攻撃を避け効率的に自身を複製できることから、その形成に関わる複製酵素には膜局在に関わるともに複製に重要なアミノ酸領域が見出されています（新万博体育_万博体育官网-【官方授权牌照】2021年9月29日プレスリリース「植物ウイルスの複製装置の形成の鍵となる膜結合領域を発見」など）。
　しかし、複製装置の形成過程における複製酵素の動態を、ウイルスが感染した生細胞で観察することは極めて困難でした。目的タンパク質の生細胞での可視化（イメージング）には蛍光タンパク質（fluorescent protein; FP）（注5）を目的タンパク質に融合させる手法が一般的です。しかしFPは200個以上のアミノ酸残基から構成される巨大な分子のため、複製酵素に融合させると複製酵素の立体構造を変えてしまい、その機能を損なう点が問題となっていました。さらに、ウイルスの感染に重要なタンパク質の遺伝情報を担うゲノムは、動物や植物など細胞性の生物のゲノムに比べて極端にコンパクトであり、FPの配列を導入すると多くの場合ウイルスゲノムの機能が保たれないことも課題となっていました。

研究成果
　本研究では、世界中でさまざまな農作物に甚大な被害をもたらしている植物ウイルスの一群「ポテックスウイルス」（注6）の1種であるオオバコモザイクウイルス（Plantago asiatica mosaic virus: PlAMV）の感染細胞における複製酵素のイメージングを目標としました。
　そのために本研究グループが着目したのが2019年に報告された遺伝子コード型の抗体プローブ「Frankenbody（フランケンボディ）: FB」（注7）です。抗体（注8）は病原体などのタンパク質の表面に存在する結合部位（エピトープ）と相互作用することで機能します。これまでに、インフルエンザウイルスの膜タンパク質の表面に存在するHAエピトープなどがよく研究され、エピトープをタグとして用いることで、タンパク質の検出などに利用されてきました。動物の生細胞では、FBと蛍光タンパク質と融合させて発現させると、HAエピトープを融合させたタンパク質を可視化しその細胞内での局在を調べられることが報告されていました。
　本研究グループはまず、抗体プローブFBに蛍光タンパク質の一種であるmCherryを融合させたFB-mCherryを植物の生細胞で発現させると、HAエピトープを持つ小胞体（注9）局在性タンパク質のネットワーク状の局在をラベルできることを示しました（図1）。次に、PlAMVの複製酵素のC末端にHAエピトープを融合させた改変ウイルスを作出し（図2）、このウイルスが細胞で元のウイルスと同様に複製を行うことを確認しました。そのうえで、HA融合複製酵素の細胞内動態の観察をFB-mCherryを用いて試みましたが、ウイルスの複製酵素の蓄積量は極めて少なく、FB-mCherryが多量に存在する条件ではウイルス複製酵素に特異的な蛍光を観察することはできませんでした。
　そこで次に、FB-mCherryがウイルス複製時にのみ発現するように人工転写因子を用いた二成分系（注10）を導入し、結果として、PlAMVの複製している細胞で、HA融合複製酵素が小胞体のネットワークや原形質連絡（注11）に近接した顆粒を形成することを見出しました（図3）。この顆粒はまた、ウイルス複製中間体である2本鎖RNA（注12）とも近接していました（図4）。本研究で明らかになったウイルス複製時に観察される複製酵素の顆粒の局在は、原形質連絡の入り口付近で2本鎖RNAを伴って複製が行われるという、これまでの研究で他の実験系により提唱されたポテックスウイルスおよび近縁な植物ウイルスの複製装置の特徴と一致しており、本法の有用性を示すものです。

研究体制
　本研究は、新万博体育_万博体育官网-【官方授权牌照】大学院農学府大学院生の石原千有沙（2024年3月修士課程修了）、角田友弘（2020年3月修士課程修了）、同大学大学院農学研究院生物制御科学部門の小松健教授、同大学大学院応用生物化学部門の佐々木信光准教授、同大学学術研究支援総合センターの松下保彦教授、同大学大学院農学研究院生物制御科学部門の有江力教授、オクラホマ州立大学のRichard Nelson博士らによって実施されました。本研究は、JSPS科研費 基盤研究（B）23K26904および新万博体育_万博体育官网-【官方授权牌照】グローバルイノベーション研究院の助成を受けて実施されました。

今後の展開
　本研究では、エピトープタグに結合する抗体プローブの技術を植物に適用することに成功しました。本成果は、近年技術の進展が目覚ましい抗体テクノロジーを利用しており、ウイルス由来のタンパク質だけに限定されず、植物が作るさまざまなタンパク質の細胞内動態をそれらの機能を維持したまま可視化することを可能にしたもので、植物におけるタンパク質の動態イメージングへの広い活用が期待されます。また、このシステムを利用して、ウイルスがどのように植物�